溶酶体pH值荧光检测试剂盒

产品货号：

HR9116

中文名称：

溶酶体pH值荧光检测试剂盒

英文名称：

Lysosome pH Detection Kit

产品规格：

50T|100T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒采用BalBcellProbe P09溶酶体pH值荧光探针定性检测溶酶体pH值的变化，主要用于溶酶体pH值变化的定性检测。

BalBcellProbe P09适合溶酶体pH检测的荧光探针，它是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，是一种嗜酸性的荧光染料，它在较低的pH下发出强烈的橙红色荧光。P09进入细胞后，会产生特异性的溶酶体聚集。产生的荧光物质最大激发波长为386nm，最大发射波长为550nm，其在不同的pH值条件下发射的荧光强度不同，从而可以反映溶酶体pH值的变化情况。

BalBcellProbeP09荧光光谱：
溶酶体pH值荧光检测试剂盒

BalBcellProbe P09是pH敏感的荧光染料，在采用橙红色发射光检测时，其荧光强度随着pH值降低而增强，反之碱性条件下变低，从而BalBcellProbe P09可被用于监测溶酶体pH变化。

溶酶体pH是酶活性和细胞功能的重要生理决定因素，所有蛋白质都依赖于严格调节的pH值以维持其结构和功能。质子-去质子化可以指示生物表面的电荷，并且是许多代谢反应中的组成部分。细胞已经开发出多种机制来保持pHi的窄范围，以响应pH值的细胞内和细胞外波动。而市面上现有的pH探针不适用于研究酸性细胞器如溶酶体，内涵体，精子和顶体，因为它们的荧光在较低pH下显著降低。另外，市面上现有的pH探针不能选择性地定位于酸性细胞器中。

BalBcellProbe P09主要用于哺乳动物细胞的研究。在有溶酶体pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中也可应用。实际检测时推荐使用的激发波长为380～405nm左右，发射波长为540～570nm。可以使用酶标仪、光度计、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测溶酶体pH值的变化。

组分	50T	100T	保存
BalBcellProbe溶酶体pH荧光探针P09	50μL	50μL×2	-20℃，避光
探针稀释液	10mL	10mL	2～8℃

保存：2～8℃，有效期1年。

保存事项

探针液长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
探针液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完！

本试剂盒内P09探针母液500～2000倍稀释后使用，一般500倍稀释使用即可，按每个样500μL计算，50μL母液至少可以做50个细胞样品。

仪器准备	荧光酶标仪/分光光度计/流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦离心机移液器冰箱冰盒
试剂准备	PBS缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））（phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl） HBSS（With：Calcium Magnesium Glucose；Without：Phenol Red。Components：CaCl₂(anhydrous) 140mg/L(1.261mM)、MgCl₂-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous) 48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)） HEPES缓冲液
耗材准备	离心管吸头一次性手套荧光检测用黑色96孔板

预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
旋帽盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
pH探针为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
BalBcellProbe P09探针容易受潮，受潮后稳定性较差，注意干燥保存。
吸取BalBcellProbe P09探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。
未使用完的BalBcellProbe P09探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
BalBcellProbe P09探针工作液含水，配制后不可以长期保存，须现配现用。
细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
染色后立即进行分析。
可以在染色溶液中加入等体积的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127可以帮助BalBcellProbe P09更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存BalBcellProbe P09溶液。
本试剂盒主要用于溶酶体pH值变化的定性检测。但是在一定pH值范围内荧光强度与溶酶体pH有良好的线性关系，从而可以换算出溶酶体的pH值的具体数据。如果需要制备标准曲线换算溶酶体pH值数值，可以联系百奥莱博技术邮箱bjbalb@126.com索取参考方法。
荧光酶标仪检测时必须使用黑色96孔板。

染色工作液的配制：
根据样品数，用探针稀释液将P09探针进行10倍稀释，然后再用HBSS缓冲液稀释BalBcellProbe P09溶液50倍～100倍，配制成BalBcellProbe P09染色工作液。
- 推荐该探针加载终浓度为试剂盒中母液的500～2000倍稀释，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。一般起始浓度用500～1000倍稀释即可。不同细胞需要的浓度不同。
- 也可以不用试剂盒中提供的探针稀释液稀释探针，直接用HBSS缓冲液稀释。也可以用PBS直接稀释探针。
- 不能用含血清的培养基稀释探针。
- 也可以用以下缓冲液稀释后用于染色，直接将pH探针加入，终浓度在500～2000倍稀释即可。最佳的稀释液应能兼顾两方面——染料加载和良好的细胞反应。可能的选择有：Hank's BSS 1X + 20mM HEPES；Hank's BSS 1X + 20mM HEPES +1% BSA。
- 优化细胞种板的密度是很有必要的，保证了过夜培养后每孔可以形成密度相似的均一单细胞层。通过适当的调整种板时的密度，细胞可以培养超过一天来达到实验当天的要求。粘附性弱或生长不规则的细胞最好在用多聚赖氨酸、层黏蛋白或胶原蛋白包被过的多孔板中培养。
将BalBcellProbe P09染色工作液加入已处理好的细胞，在37℃孵育1～5分钟。
- 最佳的孵育时间取决于细胞类型。由于荧光染料对细胞是有毒的，所以要严格控制孵育时间。5分钟、37℃是通常对大多数细胞都有效的孵育条件，一般也作为方法摸索时的起始推荐条件。如果孵育1分钟可以得到一个可接受的荧光信号，建议采用更短时间的孵育条件。
- 关于阴离子交换蛋白抑制剂：一些类型的细胞通过阴离子交换蛋白转移阴离子至细胞外，这些阴离子包含了P09荧光染料。这样不仅仅导致了染料加载效果的减弱，同时导致了最终数据结果的误差；丙磺舒是一种阴离子交换蛋白抑制剂，被加入到加载培养基中后可以增加染料保留在溶酶体的比例。已知的一个需要丙磺舒的细胞类型是CHO。尽管丙磺舒可以延缓染料从溶酶体被转移至胞外，但其对细胞来说有一定的毒性，因此染料加载后的孵育时间应尽可能控制在最短时间内。丙磺舒一般不需要使用，有条件则使用。
然后用该细胞进行荧光溶酶体pH变化情况检测。
- 激发波长360～405nm，发射波长540～570nm。
- 荧光强度增加则溶酶体pH值降低，荧光强度降低则溶酶体pH值上升。

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